Engagé dès 1924 au sein du Parti communiste italien (PCI), il subit la répression du régime de Mussolini et est condamné à 16 ans de prison pour militantisme anti-fasciste.
Pendant cette période d’incarcération notamment sur l'île de Ventotene, il s’éloigne progressivement de la pensée communiste et marxiste. Il y corédige clandestinement, avec Ernesto Rossi, en 1941 le Manifeste de Ventotene, qui identifie l'État-nation comme la cause des conflits mondiaux et préconise la création d'une fédération européenne comme priorité absolue pour garantir la paix et la liberté.
Dès sa libération en 1943, Spinelli fonde le Mouvement fédéraliste européen, dont le programme s’inspire largement du Manifeste de Ventotene.
Pendant la période de la construction européenne, il alterne entre rôles de conseiller politique — tout d’abord d’Alcide De Gasperi en 1951, puis de Pietro Nenni — et fonctions institutionnelles, en tant que membre de la Commission européenne chargé de la politique industrielle et de la recherche, puis au Parlement européen dès 1976.
Altiero Spinelli est rapporteur de la Commission institutionnelle qui propose le projet de traité d’Union européenne adopté le 14 février 1984 par le Parlement européen.